1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)

　　答： 靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。方便，特異性高。

　　2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？

　　答： 原因有很多: a） 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b） 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。

　　3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

　　答： a） 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性*，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。

　　4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？

　　答：可以選擇0.2μml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。

　　5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？

　　答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。

　　6、膠片背景很臟，有什么解決方法？

　　答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。

　　7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？

　　答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。

　　8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？

　　答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

　　a） 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d） 二抗失活。

　　9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

　　答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時(shí)間過長。

　　10、DAB好還是ECM好？

　　答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

　　11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

　　答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基量，煮沸變性時(shí)間延長，可以打開二聚體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等

　　12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？

　　答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。

　　13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？

　　答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。

　　14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？

　　答： ① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。

　?、?兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

　　15、做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

　　答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

　　16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？

　　答：一般5×10^6就足夠了

　　17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？

　　答：能，沒有問題。

　　18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

　　答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品。

　　19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

　　答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

　　20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？

　　答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長時(shí)間，加20％。

　　21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？

　　答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7％，積層膠 3.5％。

　　22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？

　　答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。

　　23、蛋白變性后可以存放多久？

　　答：－80℃，一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。

　　24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

　　答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。

　　25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？

　　解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．

　　26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

　　答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。

　　27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？

　　答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

　　28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

　　答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

　　29、有什么方法可以提高上樣量？

　　答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性

　　30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

　　答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載.

　　31、一抗，二抗的比例是否重要？

　　答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

　　32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

　　答：對二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。

　　33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

　　答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

　　34、Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？

　　答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

　　35、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用浸泡的目的？

　　答：PVDF膜用泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加也是這個(gè)目的。

　　36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

　　答：可以。

　　37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？

　　答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。

　　38、做Western Blot時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？

　　答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。

　　39、如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？

　　答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般zui少為3－5ml。

　　40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到*效果。

　　答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液

　　41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

　　答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。

　　42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

　　答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE， 濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

　　43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

　　答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%（是指終濃度），因?yàn)榭山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，可以防止凝膠變形，對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）.

　　44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

　　答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。

　　45、是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？

　　答：對于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。

　　46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？

　　答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

　　47、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？

　　答：選用beta-actin就可以。

　　48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？

　　答：一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。

　　49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBSTzui后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？

　　答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L.

　　50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

　　答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過夜。

　　51、請問一下PVDF膜和膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

　　答：一般而言，纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

　　52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

　　答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：1、電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

　　53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?

　　答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中，會(huì)透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。