前言

自然殺傷細(xì)胞（Nature Killer Cells, NK）是骨髓衍化的淋巴細(xì)胞，其zui初通過巨大的顆粒性狀被識別。NK細(xì)胞能自發(fā)殺滅多種腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還可保護(hù)正常的細(xì)胞，從而被認(rèn)為是癌癥的克星。zui重要的是，不管是在胞內(nèi)還是胞外，NK細(xì)胞不需要免疫接種或提前激活，就能夠自發(fā)溶解特定的腫瘤靶細(xì)胞，而T細(xì)胞必須要通過抗原遞呈細(xì)胞的協(xié)助才能發(fā)揮作用。許多胞內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)表明, 除了外滲出和滲入腫瘤組織的能力外，NK細(xì)胞還有望具有抗腫瘤的能力。研究發(fā)現(xiàn)缺失NK細(xì)胞的小鼠在致癌物誘下更容易發(fā)產(chǎn)生癌癥。另外，缺乏NK細(xì)胞的小鼠會持續(xù)遭受病毒感染，并很快死亡。很多疾病的發(fā)生會伴隨NK細(xì)胞失控或出現(xiàn)不正常反應(yīng)，包括移植排斥，糖尿病，各種自身免疫和神經(jīng)性疾病,再生障礙性貧血或白血球減少癥。因此，NK細(xì)胞在決定各生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)中起著舉足輕重的作用。同時(shí)， 監(jiān)測NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，不僅可應(yīng)用于監(jiān)視癌癥、傳染病和自身免疫性疾病的免疫活性，而且可應(yīng)用于搜尋介導(dǎo)細(xì)胞溶解效應(yīng)的蛋白。

測量NK細(xì)胞溶解活性的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法是用⁵¹Cr或¹¹¹In進(jìn)行放射性標(biāo)記分析。

在這些分析中，靶細(xì)胞被放射性標(biāo)記，然后與效應(yīng)細(xì)胞混合。在給定時(shí)間內(nèi)（低于四小時(shí)）檢測放射性同位素的釋放（與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解有關(guān)）。也可以使用一些非放射性標(biāo)記方法進(jìn)行檢測，包括流式細(xì)胞術(shù)，基于ELISA的顆粒酶測量，及利用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析3。

由ACEA 公司及羅氏應(yīng)用科學(xué)部共同開發(fā)的實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)xCELLigence，使動態(tài)監(jiān)測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解成為可能。xCELLigence基于阻抗技術(shù)（RT-CES®）^4,5，貼附于E-Plate的96孔板孔中的細(xì)胞，其貼壁能力及相互作用都會導(dǎo)致阻抗發(fā)生變化，同時(shí)，阻抗的變化與貼壁細(xì)胞的數(shù)量，大小，形狀變化都有關(guān)系。相反，向板孔中加入懸浮細(xì)胞，因?yàn)槠洳慌c檢測板電阻接觸或者只是微弱接觸，所以不引起電阻抗變化。因此，NK細(xì)胞介導(dǎo)的單層癌細(xì)胞細(xì)胞溶解效應(yīng)，可在E-Plate上進(jìn)行動態(tài)的定量監(jiān)測，而無需對靶細(xì)胞進(jìn)行額外的標(biāo)記。

材料和方法

細(xì)胞

NK 92, NIH 3T3細(xì)胞以及試驗(yàn)中用到的所有的癌細(xì)胞均購自ATCC，小鼠NK細(xì)胞（mNK）由Louisville大學(xué)Hui Shao博士提供。所有的細(xì)胞均培養(yǎng)在5% CO2，37°C的培養(yǎng)箱中，NK92和mNK細(xì)胞在含有2 mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.2 mM肌醇，0.1 mM 2-巰基，0.02 mM葉酸，12.5%馬血清，12.5% FBS，100-200 U/ml IL-2重組體的Alpha MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其它癌細(xì)胞培養(yǎng)在含有5% FBS，1%青霉素，1%螺旋霉素（GIBCO）的RPMI培養(yǎng)基中。NIH 3T3細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS，1%青霉素，和1%螺旋霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

細(xì)胞溶解分析

靶細(xì)胞接種于96孔E-Plates上，每孔100 μl培養(yǎng)基。使用xCELLigence系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞直到對數(shù)期，此時(shí)形成了一細(xì)胞層（24-34小時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)）。不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞直接加入到含有靶細(xì)胞的各孔中，效應(yīng)細(xì)胞加入到不含靶細(xì)胞的孔作為對照。加入效應(yīng)細(xì)胞后，每隔15分鐘記錄一次測量結(jié)果，連續(xù)記錄20小時(shí)。

細(xì)胞形態(tài)鏡檢分析

使用Nikon直立顯微鏡觀察NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解效應(yīng)。加入效應(yīng)細(xì)胞后，當(dāng)細(xì)胞指數(shù)（Cell Index）相比對照下降到50%時(shí)，取出細(xì)胞用80%的固定5分鐘，使用Giemsa染色。鏡檢細(xì)胞形態(tài)學(xué)并用CCD相機(jī)進(jìn)行記錄。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用xCELLigence系統(tǒng)自帶的軟件，可對實(shí)驗(yàn)全過程，即從接種到細(xì)胞溶解，進(jìn)行顯示。通過實(shí)時(shí)顯示時(shí)間-E/T（效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值）的依賴性曲線，可動態(tài)監(jiān)測NK細(xì)胞的活性。xCELLigence系統(tǒng)使用細(xì)胞指數(shù)（Cell Index）表示細(xì)胞阻抗。每點(diǎn)的CI值定義為（Rn-Rb）/15，其中Rn表示孔含細(xì)胞時(shí)的電極阻抗值，Rb是表示孔中只含培養(yǎng)基時(shí)的背景阻抗值。

為了對特定點(diǎn)細(xì)胞溶解進(jìn)行定量，通過與對照的參比，特定E/T比率下的細(xì)胞溶解百分比以Excel形式輸出。

結(jié)果和討論

動態(tài)檢測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解

利用鼠NK細(xì)胞（mNK ）及靶細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞來監(jiān)測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性。在96孔E-Plates板的每孔中接種5,000個(gè)NIH3T3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，xCELLigence系統(tǒng)每小時(shí)記錄生長數(shù)據(jù)，直到34小時(shí)后細(xì)胞達(dá)到生長期。鼠NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以不同的E/T比例直接加入到孔中，動態(tài)監(jiān)測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解過程。如圖1A所示，與對照相比，當(dāng)加入的mNK細(xì)胞E/T為15/1的時(shí)候，NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)出現(xiàn)明顯的下降。而在效應(yīng)對照孔中加入YAC細(xì)胞（無細(xì)胞溶解效應(yīng)的T細(xì)胞），細(xì)胞指數(shù)沒有出現(xiàn)明顯的下降。這表明細(xì)胞指數(shù)的下降是由mNK特異性引起的，并且很有可能是由細(xì)胞溶解造成的。mNK細(xì)胞能夠引起NIH 3T3細(xì)胞的時(shí)間依賴性溶解，但YAC細(xì)胞沒有該效果（圖1B）。為了進(jìn)一步證明細(xì)胞溶解效應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞溶解達(dá)到50%時(shí)（添加mNK細(xì)胞后8小時(shí)），對靶細(xì)胞進(jìn)行鏡檢。如圖1C所示，mNK細(xì)胞通過細(xì)胞溶解作用很快將靶細(xì)胞有效地清理掉，而對照YAC細(xì)胞對靶細(xì)胞沒有任何影響。

總之，使用xCELLigence系統(tǒng)是目前*一種，不需要對靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記或添加任何化學(xué)指示物，就能夠直接檢測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的方法。另外，該系統(tǒng)可以動態(tài)監(jiān)測整個(gè)細(xì)胞溶解過程，這是利用基于標(biāo)記的終點(diǎn)分析法所不能做到的。

圖1：動態(tài)監(jiān)測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解

（A） 動態(tài)監(jiān)測 NK細(xì)胞介導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞溶解。96孔E-Plate板每孔中接種5000個(gè)NIH3T3細(xì)胞。實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞粘附，擴(kuò)散和增殖。細(xì)胞接種后34小時(shí)，CI值為3，等同于每孔大約10000細(xì)胞。每孔加入150,000mNK細(xì)胞或YAC細(xì)胞（陰性對照），每組三重復(fù)孔。（B）mNK細(xì)胞的時(shí)間依賴性溶解活性。計(jì)算特定時(shí)刻的細(xì)胞溶解活性，用細(xì)胞溶解百分比表示{細(xì)胞溶解%=（CI_對照－CI_{效應(yīng)細(xì)胞}）/CI_對照X 100}。（C）mNK細(xì)胞作用后的形態(tài)學(xué)觀查。NIH 3T3細(xì)胞被mNK細(xì)胞特異性細(xì)胞溶解后，用Giemsa blue 染色后進(jìn)行鏡檢。

定量檢測NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解

細(xì)胞指數(shù)與細(xì)胞數(shù)目有關(guān)⁵，已經(jīng)被用于定量監(jiān)測化學(xué)物質(zhì)，如抗癌藥引起的細(xì)胞毒性。為了檢驗(yàn)mNK細(xì)胞的活性是否也可以定量分析，用不同比例的效應(yīng)/靶細(xì)胞來檢測細(xì)胞溶解。利用鼠和人的NK細(xì)胞（mNK和NK92）作為效應(yīng)細(xì)胞，NIH 3T3細(xì)胞和MCF7細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞）分別作為效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞。如前所述，96孔 E-Plate板每孔接種5000個(gè)靶細(xì)胞，并用阻抗系統(tǒng)監(jiān)測細(xì)胞生長。當(dāng)靶細(xì)胞達(dá)到生長期，直接加入不同濃度的NK細(xì)胞。監(jiān)測不同E/T比的NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。

如圖2所示，向靶細(xì)胞中加入mNK或NK92細(xì)胞后，與未加效應(yīng)細(xì)胞的對照相比，細(xì)胞指數(shù)降低了。細(xì)胞指數(shù)的降低是依賴于E/T比的。細(xì)胞溶解過程中，細(xì)胞與電極相互作用的降低引起了細(xì)胞指數(shù)的降低。E/T越大，得到的細(xì)胞指數(shù)值越小。表明xCELLigence系統(tǒng)支持特異性NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性的定量分析。而且，通過細(xì)胞溶解的動態(tài)監(jiān)測，有助于更深入理解NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用的潛在機(jī)理。例如對細(xì)胞溶解的動態(tài)分析，表明NK92細(xì)胞比mNK細(xì)胞的殺傷能力更強(qiáng)，E/T為4：1或更高時(shí)，加入NK92四小時(shí)內(nèi)，90%的MCF7細(xì)胞都被溶解，而在相同的時(shí)間內(nèi)加入mNK細(xì)胞只引起30%細(xì)胞溶解，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解動力學(xué)各不相同，表明效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的相互作用，本質(zhì)上是細(xì)胞特異性的，而且會有諸多因素的參與，如NK受體和配體的表達(dá)，或NK細(xì)胞介導(dǎo)的不同細(xì)胞溶解機(jī)制。

圖2：無標(biāo)記定量分析mNK 和NK92細(xì)胞的溶解活性。（A）mNK細(xì)胞溶解活性的定量分析。NIH 3T3細(xì)胞接種到96孔E-Plate板，使用xCELLigence 系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測，直到CI值達(dá)到3，相當(dāng)于每孔10,000個(gè)細(xì)胞。將不同濃度的mNK細(xì)胞以不同的E/T接種到靶細(xì)胞中，并動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞的溶解活性。利用歸一化的細(xì)胞指數(shù)值表示，即加入mNK細(xì)胞得到的細(xì)胞指數(shù)值與同一孔加入mNK細(xì)胞前的細(xì)胞指數(shù)值的比 。（B） 不同E/T比下mNK的時(shí)間依賴性細(xì)胞溶解活性。mNK細(xì)胞介導(dǎo)的NIH 3T3的細(xì)胞溶解百分比的計(jì)算方法如圖1。時(shí)間依賴性細(xì)胞溶解活性如圖所示。（C）對NK92 細(xì)胞溶解活性的進(jìn)行定量。接種MCF7靶細(xì)胞，xCELLigence系統(tǒng)監(jiān)測細(xì)胞生長， NK92細(xì)胞以不同E/T比加入到靶細(xì)胞中，系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測不同E/T比下的NK92細(xì)胞對MCF7的細(xì)胞溶解活性。（D）不同E/T比下的時(shí)間依賴性NK92細(xì)胞的溶解活性。NK92細(xì)胞對MCF7的細(xì)胞溶解百分比的計(jì)算方法如圖1。

無標(biāo)記分析NK細(xì)胞對多種靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性

利用8種不同的人類癌細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，測試mNK和NK92的細(xì)胞溶解活性，表1和2總結(jié)了mNK 和NK92介導(dǎo)的細(xì)胞溶解對不同靶細(xì)胞的敏感性。NK92對癌細(xì)胞具有廣譜細(xì)胞溶解活性。加入NK92不到8小時(shí)就能夠達(dá)到zui大殺傷活性。圖3A對比了NK92細(xì)胞對7種癌細(xì)胞的敏感性，其中四種靶細(xì)胞都出現(xiàn)超過90%的細(xì)胞溶解，包括H460, HepG2, Hela和MDA-MB231細(xì)胞。相反，mNK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解比NK92更具有選擇性（圖3B），參加測試的9種細(xì)胞中僅有4種（NIH3T3, A549, Hela, and MDA-MB231）在加入mNK細(xì)胞后的12小時(shí)內(nèi)，發(fā)生30%以上的溶解。OVCAR4, HT1080, HepG2, H460和MCF7五種細(xì)胞沒有發(fā)生溶解，或只是微弱的溶解（10%）。另外，mNK介導(dǎo)的細(xì)胞溶解比NK92要慢得多，加入mNK12小時(shí)后才達(dá)到zui大值。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明，基于阻抗的xCELLigence系統(tǒng)可以用于NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性的分析，且無需任何標(biāo)記。人和鼠的NK細(xì)胞被用來對9種靶細(xì)胞（包括通常使用的人癌細(xì)胞）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)可以對NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解進(jìn)行動態(tài)定量分析，無需任何外源標(biāo)記和額外試劑。而且這種全新的技術(shù)提供了全自動在線細(xì)胞溶解分析，可以用于大規(guī)模的篩選調(diào)節(jié)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的化合物或基因。

圖3：無標(biāo)記分析NK細(xì)胞介導(dǎo)的多種細(xì)胞溶解（A）NK92細(xì)胞介導(dǎo)的7種癌細(xì)胞溶解。細(xì)胞溶解的百分比是通過加入NK92細(xì)胞8小時(shí)后 計(jì)算細(xì)胞指數(shù)值得到的；此刻細(xì)胞溶解達(dá)到zui大。（B）mNK細(xì)胞介導(dǎo)9種不同細(xì)胞溶解。細(xì)胞溶解的百分比通過加入mNK后12小時(shí)的細(xì)胞指數(shù)值計(jì)算得到的，此時(shí)細(xì)胞溶解達(dá)到zui大。

表1： mNK細(xì)胞介導(dǎo)的9種細(xì)胞溶解

表2：NK92細(xì)胞介導(dǎo)的7種細(xì)胞溶解

參考文獻(xiàn)

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