穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建
點(diǎn)擊次數(shù)：3618 更新時(shí)間：2010-11-24
1. 2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建
原理：
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可
長(zhǎng)期表達(dá)目的基因及蛋白。需要在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選或者應(yīng)用高轉(zhuǎn)染效率的病毒，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行細(xì)胞傳代，從而得到可穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系。
應(yīng)用：
觀察目的基因及其表達(dá)蛋白在某種細(xì)胞中的功能（穩(wěn)定，可長(zhǎng)期進(jìn)行研究）
一般流程：
1） 篩選濃度測(cè)定：以10~14天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度
2） 細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80%覆蓋
3） 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（病毒、脂質(zhì)體、電穿孔、FuGENE 6）
4） 利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選
5） 鑒定篩選結(jié)果
前期需要準(zhǔn)備：
l 構(gòu)建好的外源基因載體
l 待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系（1×106個(gè)細(xì)胞，可傳代，倍增時(shí)間小于48小時(shí)）以及細(xì)胞培養(yǎng)條件的說明
l 若需要檢測(cè)靶基因的表達(dá)變化，請(qǐng)?zhí)峁┫鄳?yīng)抗體
結(jié)果呈現(xiàn)：
構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及相關(guān)的外源基因表達(dá)分析
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